常见呼吸道病原体核酸检测技术分析
秋冬季是呼吸道感染流行季，目前包括病毒、支原体、细菌感染等患者明显增加。病原体的快速检测和精准诊断是有效治疗的前提,目前临床常用的病原体检测方法主要有4种：分离培养、抗原检测、血清抗体检测、分子检测。传统微生物学及免疫学技术灵敏度偏低，核酸检测技术有敏感性高、特异性强的优势。
日前由中华检验医学专家委员会共同撰写的《成人呼吸道感染病原诊断核酸检测技术临床应用专家共识（2023）》对呼吸道病原体核酸检测技术做了特点分析和应用场景建议，可操作性极强，本文对主要技术的原理特点进行更细致的分析。
NO.1
实时荧光PCR（qPCR）
qPCR通过在 PCR 扩增过程中实时监测荧光信号来进行核酸定量，在基因表达分析、病原体检测等领域都有广泛应用。包括两种主要方法：探针法和染料法。探针法涉及使用特定探针来监测特定序列的扩增，而染料法则使用染料与扩增的 DNA 结合产生荧光。荧光探针法的灵敏度和特异度明显优于底物发光法，但特异性引物探针的成本和对仪器的要求较高。
技术优势
（1）高灵敏度和特异性：适用于精确量化少量样本。主要是探针法。
（2）开放平台：目前是病原体核酸检测中运用最广泛的平台。
技术局限
通量：单管检测的靶标数量受荧光通道数量限制，进行多重病原体检测时常需要多管。
NO.2
等温扩增技术
等温扩增技术是一种在恒定温度下进行的核酸扩增方法，不需要传统PCR中的温度循环。等温扩增技术发展迅速、流派复杂技术原理差异较大且各具优势，但基本原理仍是以特异性酶和引物进行扩增。优势在于操作简单、扩增效率高，通常用于定性检测。
PCR与等温扩增技术的比较和几种等温扩增技术间的比较
技术优势
操作简单、扩增效率高，非常适合于现场检测和快速应答系统。
技术局限
（1）引物设计的复杂性：由于等温扩增技术涉及复杂的引物设计，这可能导致实验设计更加困难。
（2）特异性问题：某些等温扩增方法可能存在特异性不足的问题，这可能导致非特异性扩增或交叉反应。
NO.3
数字PCR (dPCR)
dPCR相较于qPCR，能直接读出核酸分子的个数,能对起始样品的核酸分子进行绝对定量。通过微流控技术将核酸样本分配到成千上万的微小反应单元中，每个单元独立进行 PCR 扩增。通过监测每个单元的扩增情况（阳性或阴性），并应用统计方法（如泊松分布）来计算样本中目标核酸分子的绝对数量。
数字PCR原理示意图
技术优势
（1）特别适用于低浓度或少量样本的精确定量；
（2）无需标准曲线和标准品，可有效减少临床样本复杂本底对扩增的干扰，具有良好的重现性和准确度。
技术局限
（1）质控问题：技术和耗材试剂具有封闭性，缺少跨平台质控方法；
（2）通量限制：依托荧光探针进行定量检测的方法受限于靶标通量；
（3）动态范围窄：由于该技术检测灵敏度为单分子水平，不适用于检测浓度相对较高的样本；
（4）成本较高：设备和运行成本高于传统 PCR。
NO.4
核酸即时检测技术（POCT）
核酸POCT为POCT技术中涉及核酸检测的一大类技术的总称，是核酸提取技术和分子扩增技术(包括实时荧光PCR、巢式PCR、等温扩增、数字PCR等技术)的融合，结合了快速核酸提取和分子扩增技术，使得从样本处理到结果获取的整个流程都能在一个紧凑、通常是便携的设备中完成。
分子诊断POCT技术举例（来源于网络）
技术优势
（1）便于操作，快速获取结果，适用于需要即时诊断的场合；
（2）便捷：设备通常便携，适合在各种环境中使用。
技术局限
（1）成本高：单次测试成本可能较高。
（2）通量受限：其检测设备一般较小，便于携带，但也导致其通量较低，不适用于大规模人群筛查。
NO.5
高通量测序技术（NGS）
NGS可以提供丰富的微生物组成信息，适用于复杂病原体的诊断和研究。目前该技术主要分为 3 类: 无偏倚检测的 mNGS、检测多重病原体及其耐药基因或毒力基因的 tNGS 和获取某一种或多种病原体全基因组数据的全基因组测序技术 WGS 。
1、宏基因组测序(mNGS)
mNGS只针对外显子区域，对测序平台和平台产出数据有着很高的要求。可以检测出多种病原体，在细菌性感染、真菌性感染和病毒性感染中都有应用。
优势：它的特异度和准确性较高，能精准定位到某种罕见病原体的感染，为明确感染病原体提供一个较为准确的方向。
局限性：包括多重感染/背景菌的判断、胞内菌/真菌检出率相对较低、RNA病原体检测要求较高等。此外，mNGS检测存在较高的多重感染率。
mNGS实验流程示例
2、靶向测序(tNGS)
tNGS是研究者对感兴趣的序列，定制探针与基因组进行杂交，将目标区域DNA富集后进行高通量测序的技术。
优势：tNGS是高通量测序技术和病原富集技术的结合，兼顾广谱性和高灵敏度。
局限性：例如背景菌干扰可能导致无法区分检测出的微生物是来源于样本还是试剂；气溶胶污染可能导致假阳性；非特异扩增、引物二聚体干扰、扩增偏好性等可能降低检出率，导致假阴性结果，可能导致漏诊或误诊。
tNGS实验流程示例
3、全基因组测序(WGS)
WGS对样本基因组中全部序列进行检测，不仅涵盖了几乎所有的外显子区域，也覆盖了内含子区域及基因间序列。
优势：覆盖区域更广。
局限性：WGS虽然能获得详尽的基因组信息，但相比于其他测序形式，测序平台需要具备通量大的特点，价格较高的局限性使其一直未被广泛使用。尽管近年来价格有所下降，也仍是其在病原体应用中的一个劣势。
NO.6
总结
目前具备医疗器械证的呼吸道商品化试剂盒之中，技术平台还是以常规qPCR平台为主，荧光法和荧光探针法。qPCR平台也是各个分子实验室必备平台,平台的开放性和多年积淀使得其被广泛应用。
明志医学推出呼吸道19种病原体核酸检测
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